邻近标记技术的原理、技术迭代与应用举例
在细胞生物学中，深入理解蛋白质之间的相互作用对于揭示细胞内的复杂生物过程至关重要。传统的研究方法，如免疫共沉淀（Co-IP）和Pull-down实验，尽管各有优势，但也有各自局限性。例如，Co-IP对抗体的特异性要求高，且可能遗漏那些短暂或较弱的相互作用；而Pull-down实验虽能在体外操作，但其结果可能无法完全反映细胞内的真实情况。于是，研究者们转向开发新的技术以更全面地探索蛋白质相互作用网络（interactome）。
蛋白质通过复杂且动态的相互作用网络执行生物学功能，而这些相互作用往往是瞬间发生的，难以用传统手段捕捉。因此，邻近标记技术（Proximity Labeling, PL）应运而生。它通过在特定的亚细胞环境中实现快速、精确的定点标记，使研究者能够捕获到那些瞬时的蛋白质相互作用。这一技术的出现，不仅为蛋白质相互作用研究提供了新的工具和视角，还极大地推动了对细胞信号传导、代谢调控等重要生物过程的深入理解。
邻近标记技术的原理与分类
邻近标记技术的核心原理是利用特定的酶将标记物（如生物素）共价连接到目标蛋白附近的蛋白质上，从而实现对邻近蛋白质的标记和后续分析。这种标记可以通过质谱技术进行检测，进而揭示蛋白质之间的相互作用关系。根据是否依赖过氧化氢（H₂O₂）刺激，邻近标记技术可以分为两大类：
依赖过氧化氢刺激的技术：以APEX（Ascorbate Peroxidase）为代表。APEX是一种过氧化物酶，它能够在过氧化氢存在的情况下催化标记反应，生成自由基，这些自由基与附近的蛋白质发生共价反应，从而实现邻近标记。APEX技术标记速度快，但由于过氧化氢可能对细胞造成毒性，使用时需严格控制条件，避免氧化应激。
不依赖过氧化氢刺激的技术：包括BioID及其衍生技术（如BioID2、Split-BioID等）和TurboID及其衍生技术（如miniTurbo、Split-TurboID等）。这些技术使用生物素连接酶，通过催化ATP与生物素之间的化学反应将生物素连接到蛋白质的赖氨酸残基上。当这种连接酶与目标蛋白融合后，它可以将生物素连接到目标蛋白邻近的其他蛋白上。此类技术无需外加刺激，操作更简便且应用范围广，已成为主流。
邻近标记技术的迭代发展
邻近标记技术被开发以来，它经历了多次技术迭代，逐渐提升了标记效率、时空分辨率以及细胞兼容性。以下是几个关键的技术迭代：
BioID：2012年，研究人员利用突变型大肠杆菌生物素连接酶BirA*，开发了最早的不依赖过氧化氢刺激的邻近标记技术BioID。该技术能在目标蛋白附近10nm范围内标记蛋白质，适合分析稳态蛋白质相互作用。尽管BioID的反应时间较长（通常需要18-24小时），但它为研究弱亲和力或瞬时蛋白质互作提供了重要工具。
BioID2：2016年开发的BioID2通过优化生物素连接酶，显著减小了酶的分子量（由35kDa减小至27kDa），提高了其在狭小亚细胞空间内的适应性。尽管其标记效率与BioID相似，但其体积减小，使其更加适合亚细胞结构研究。
Split-BioID：2017年，研究人员将BirA酶拆分为两个部分，只有当两部分通过蛋白质-蛋白质相互作用结合时，标记功能才会被激活。这一技术实现了对特定蛋白质相互作用的精确标记，使其成为探索复杂生物系统中多蛋白复合物的有力工具。
TurboID和miniTurbo：2018年，研究人员通过定向进化筛选出TurboID和miniTurbo，这两种酶的标记效率显著提高，特别是TurboID能在10分钟内完成标记。这种高时间分辨率使其适合研究快速发生的蛋白质互作和细胞信号传导通路。
APEX和APEX2：APEX技术基于过氧化物酶催化标记，在过氧化氢存在下能够快速标记邻近的蛋白质。APEX2的改进提高了其标记效率和稳定性，并能在更低的过氧化氢浓度下工作，从而减少了细胞毒性。APEX和APEX2广泛应用于高时空分辨率的蛋白质组学分析。
Split-TurboID和其他新兴技术：随着研究的深入，研究人员开发了Split-TurboID、ProtA-TurboID、BASU和AirID等多种邻近标记工具。这些新兴技术各具特色，例如Split-TurboID通过将TurboID酶拆分为两个片段，只有在相互作用发生时才会重新激活酶的功能，增加了标记的特异性。