邻近标记技术的原理、技术迭代与应用举例
邻近标记技术的具体应用
蛋白质相互作用网络的研究：邻近标记技术能够捕捉瞬时或弱亲和力的蛋白质相互作用，克服了传统技术的局限。例如，研究者通过TurboID技术可以快速筛选与特定蛋白相互作用的分子，并通过质谱技术鉴定这些相互作用蛋白，帮助揭示信号传导途径或代谢调控网络中的关键节点。
亚细胞器蛋白质组的解析：BioID和APEX等技术被广泛用于研究亚细胞器中蛋白质的组成。例如，研究者可以将APEX定向到线粒体、内质网或核孔复合体，并通过标记和质谱分析确定这些亚细胞结构中的特异蛋白，从而揭示这些结构在细胞生理功能中的作用。
动态蛋白质相互作用的时空研究：通过TurboID和APEX2等技术，研究者可以在短时间内捕捉动态发生的蛋白质相互作用。这在研究信号传导、细胞周期调控等过程中具有重要意义。例如，在胰岛素信号通路中，研究人员通过TurboID标记了与胰岛素受体相互作用的蛋白，揭示了信号传递中的关键调控因素。
光催化邻近标记技术的应用：基于光敏蛋白的邻近标记技术通过光照触发标记反应，具有良好的空间特异性。它特别适合研究细胞内动态的蛋白质-RNA、蛋白质-DNA相互作用，在研究基因表达调控等领域显示出广阔的应用前景。
应用举例
2023年，Yanting Su等人在期刊BMC Genomics上发表了题为“Study of FOXO1-interacting proteins using TurboID-based proximity labeling technology”的文章（PubMed ID：36964488）。该研究采用基于TurboID的邻近标记技术筛选并验证了与FOXO1相互作用的蛋白，为进一步研究FOXO1的功能及其参与的调控网络提供了重要信息。
2022年，Fujian Lu等人在期刊Nature Communications发表了题为“CMYA5 establishes cardiac dyad architecture and positioning”的文章（PubMed ID：35449169）。该研究在小鼠心脏中使用基于BioID的邻近标记技术，并结合蛋白质组学鉴定在特定结构附近富集的蛋白质，发现CMYA5是一种与RYR2密切相关的蛋白，对于正常心脏功能至关重要。
2023年，Sammy El-Mansi等人在期刊Blood发表了题为“Proximity proteomics identifies septins and PAK2 as decisive regulators of actomyosin-mediated expulsion of von Willebrand factor”的文章（PubMed ID：36564030）。该研究将APEX2邻近标记与创新的双重功能缺失筛选相结合，成功识别了与肌动球蛋白环功能相关的蛋白，为理解肌动球蛋白介导的血管性血友病因子排出机制提供了新视角。
2023年，Tongyu Sun等人在期刊Nature Genetics发表了题为“Crosstalk between RNA m6A and DNA methylation regulates transposable element chromatin activation and cell fate in human pluripotent stem cells”的文章（PubMed ID：37474847）。该研究结合了多重CRISPR靶向方法“Chimeric Array of gRNA Oligos”（CARGO）与生物素邻近标记（BioID）技术，开发了一种基于CRISPR的、以TE为中心的蛋白质组学方法，即CARGO-BioID。他们设计了CARGO构建体，能够同时表达多达15个sgRNA，以靶向天然染色质环境中的转座子（TEs）序列，并将催化失活的dead Cas9（dCas9）与生物素连接酶TurboID融合，预期该融合蛋白能够生物素化与其邻近以及它所指向的DNA序列上的蛋白质。通过链霉亲和素选择纯化了这些生物素化的蛋白质，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，以期鉴定出特异性富集在靶向TE位点的蛋白质。在外源性生物素处理三小时后，研究者们观察了稳定表达dCas9-TurboID-CARGO sgRNA的人类胚胎干细胞（hESCs）与表达对照sgRNA的细胞中核蛋白质的生物素化模式差异，并通过质谱鉴定了144个在LTR7位点高度富集的候选蛋白质。这些蛋白质的功能涉及组蛋白修饰、染色体组织、转录起始、mRNA处理和多能性因子信号传导等。为了避免dCas9-TurboID蛋白与DNA结合可能导致的内源互作组（包括转录因子）破坏，研究者们设计了避免预测转录因子结合基序的sgRNA，结果显示CARGO-BioID没有破坏转录和表观遗传活动所需的内源互作组。本论文中使用的 Lenti-dCas9-TurboID-blast 等质粒序列信息位于 Addgene 440259。