CUT&RUN实验中的甲醛交联与MNase酶切割

MNase（Micrococcal nuclease）是一种特殊的核酸酶，广泛应用于染色质结构和核蛋白相互作用的研究中。

MNase酶切割效率的影响因素有以下几个：

1. 酶浓度：MNase的浓度会直接影响其切割效率。过高的浓度可能导致过度切割，而过低的浓度则可能导致切割不完全。
2. 反应时间：MNase切割的反应时间越长，切割效率越高。但是，切割时间过长也可能导致过度切割。
3. 温度：MNase的活性会受到温度的影响。一般来说，在适宜的温度范围内，MNase的活性较高，切割效率也较高。
4. pH值：MNase的活性也受到pH值的影响。一般来说，MNase在较为中性的pH条件下表现最佳。
5. 存在的离子浓度：某些离子（如Mg2+）对MNase的活性有促进作用。在适宜的离子浓度下，MNase的切割效率会提高。
6. 染色质结构：MNase的切割效率还与染色质的结构相关。染色质越紧密，MNase的切割效率可能会降低；而染色质松弛，MNase的切割效率可能会提高。

甲醛是一种常用的交联剂，用于固定细胞或组织中的染色质和蛋白质分子，以稳定其相互作用并保护其结构。CUT&RUN实验中，甲醛交联可以使染色质和核蛋白复合物的结构变得更加紧密和稳定，这可能会增加MNase酶切割的难度：

1. 染色质的紧密度：甲醛交联可以增加染色质的紧密度，使得DNA和蛋白质更紧密地结合在一起。这种紧密度的增加会使MNase酶难以进入到染色质中，从而降低MNase酶的切割效率。
2. DNA的交联：甲醛交联会使DNA分子之间发生交联，形成DNA-DNA交联物。这些交联物会阻碍MNase酶的切割，导致切割效率降低。
3. 蛋白质的交联：甲醛交联还会引起蛋白质之间的交联，形成蛋白质蛋白质交联物。这些交联物可以阻碍MNase酶与染色质上的核蛋白结合，从而降低MNase酶的切割效率。

因此，CUT&RUN实验中，对于经过甲醛交联的样品，在进行MNase酶切割时可能需要使用更高的酶浓度或延长切割时间，以克服交联所引起的限制。

使用CST或诺唯赞的CUT&RUN kit中的pG-MNase时，切割不充分会影响靶片段释放，导致拉下的DNA量不足和Peak数少。但MNase酶切割时间过长，会引起非特异性切割和背景过高。CST试剂盒提到交联会影响切割后的片段释放至胞外，但未给出比较好的解决办法。

但是总体上，与CUT&Tag相比，CUT&RUN实验条件的掌控难度相对较大。CUT&RUN实验增加甲醛交联步骤之后的效果反而很差。

1. 1