eccDNA鉴定分析中的生物信息学进展
目前检测eccDNA的实验方法主要有三类：全基因组测序（WGS）实验、eccDNA富集实验以及包括ATAC-seq在内的其他实验技术。
传统的WGS方法能够同时捕获线性基因组与eccDNA序列，但由于eccDNA相较于线性基因组的丰度往往极低，仅有部分高拷贝数的eccDNA能在WGS数据中得以显现。为更全面地描绘eccDNA的图谱，研究者们开发了多种eccDNA富集技术，结合高通量测序以识别低背景噪声下的eccDNA。其中，Circulome-seq、Mobilome-seq、Circle-seq及CIDER-seq等方法尤为突出。Circle-seq通过内切酶与外切酶消化线性DNA，随后利用高效的ϕ29 DNA聚合酶对eccDNA进行滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）；Mobilome-seq则仅依赖外切酶消化线性DNA，以最大化保留eccDNA分子；CIDER-seq采用质粒提取试剂盒提取eccDNA，同时保留线性DNA；而Circulome-seq则利用Tn5转座酶系统进行片段化与标记，有效避免了RCA过程中可能引入的伪影。此外，ATAC-seq数据集同样可用于eccDNA的识别。ChIP-seq、ChIA-PET及Hi-C等技术则进一步揭示了eccDNA的染色质可及性与核小体压缩状态，为eccDNA的精细表征提供了有力支持。近期，单细胞全基因组测序方法SMOOTH-seq及单细胞eccDNA富集技术，如scEC&T-seq、scGTP-seq和scCircle-seq，已被成功开发，实现了在单细胞水平上对eccDNA的检测与特征描述。
eccDNA的识别标准不仅涉及覆盖eccDNA连接断点的测序读段，还包括因eccDNA拷贝数变异而导致的测序深度分布变化，这是减少假阳性结果的关键过滤条件。因此，将测序读段与参考基因组进行比对成为几乎所有工具的必要步骤，其中，bwa与minimap2分别是NGS与第三代测序（TGS）数据的优选比对工具。
值得注意的是，除了基于机器学习（machine learning, ML）模型预测eccDNA存在的Deepcircle外，其余所有工具均依赖于eccDNA的连接断点（joint breakpoints, BP）证据来实现eccDNA的准确识别。
基于断点的eccDNA识别工具
来自染色体断裂的DNA片段通过连接形成环状结构，进而产生连接点，这些连接点即为eccDNA的断点所在。跨越这些断点的扩增DNA片段，作为识别eccDNA最直接且有力的证据，其在NGS数据中主要表现为两种读段类型：一是分裂读段（split reads, 或称软剪读段, soft-clipped reads），这类读段的所有片段能够比对到参考基因组的不同位置，从而精确揭示eccDNA断点的基因组坐标；二是不一致读段对（discordant read pairs），它们的方向与参考基因组中的预期方向相悖，暗示了eccDNA的存在，但遗憾的是，它们无法直接提供断点的具体位置信息。目前，绝大多数生物信息学方法都是基于这两类读段特征来识别eccDNA。
Circle_finder作为首个针对NGS数据设计的eccDNA识别工具，它巧妙地结合了不一致读段对和分裂读段的信息来精准捕捉eccDNA的信号。然而，仅凭读段信息来确定eccDNA的存在，往往会导致较高的假阳性率。为了降低这一风险，后续的研究开始融入更多的eccDNA特征以及测序读段的辅助证据：eccDNA的存在会显著提升其所在区域的拷贝数，特别是在线性DNA被移除或消化的实验条件下，这种拷贝数的增加尤为明显。Circle-Map通过细致分析候选eccDNA断点周围的测序深度变化以及区域内的覆盖率，有效地过滤掉了大量假阳性候选。而ECCsplorer则采取了一种更为全面的策略，它分别识别出具有不一致读段对、分裂读段以及局部高覆盖率的基因组区域，随后将这些候选区域进行匹配或重叠比较，最终输出可靠的eccDNA结果。此外，ECCsplorer还支持对照样本数据的分析，从而能够检测到特定富集的eccDNA。
近年来，随着计算方法的不断进步，研究者们开始揭示复杂eccDNA的精细结构，这些结构往往由来自一个或多个染色体的多个不连续DNA片段组成。DMFinder便是一个杰出的代表，它整合了拷贝数变异算法RDXplorer以及两种结构变异预测算法BreakDancer和Delly，通过将这些算法的结果融入基于图的算法中，DMFinder能够从NGS数据中准确预测出复杂的eccDNA结构。类似地，AmpliconArchitect (AA)也是基于拷贝数变异（CNV）和结构变异（SV）的分析结果，它利用不一致读段对和分裂读段构建出断点图，进而将图分解为简单循环，并可视化地呈现出重构的eccDNA结构。